Amplifikacja ampC w E. coli – mechanizmy nabywania oporności

Jak E. coli nabywa oporność na amoksycylinę?

Antybiotyki beta-laktamowe, w tym amoksycylina, należą do najczęściej stosowanych leków w leczeniu zakażeń bakteryjnych u ludzi i zwierząt. Ich powszechne użycie doprowadziło jednak do rozprzestrzenienia się mechanizmów oporności, które stanowią poważne wyzwanie kliniczne. U bakterii Gram-ujemnych, w tym Escherichia coli, głównym mechanizmem oporności na beta-laktamy jest produkcja beta-laktamaz – enzymów rozkładających te antybiotyki.

Szczególnie interesującym mechanizmem jest amplifikacja genu ampC, kodującego beta-laktamazę chromosomalną. E. coli potrafi zwiększyć liczbę kopii tego genu nawet ponad 200-krotnie w odpowiedzi na ekspozycję na rosnące stężenia amoksycyliny. Proces ten zachodzi poprzez duplikację lub amplifikację fragmentów chromosomalnych zawierających ampC, co prowadzi do nadprodukcji enzymu i wysokiego poziomu oporności.

Kluczowym pytaniem pozostaje, czy istnieją preferowane miejsca genomowe dla amplifikacji ampC i które sąsiadujące geny są “porywane” w tym procesie jako pasażerowie (tzw. hitchhiking genes). Odpowiedź na te pytania może pomóc zrozumieć, dlaczego niektóre warianty bakteryjne rozwijają oporność szybciej niż inne.

Jak badano mechanizmy amplifikacji genu ampC?

Zespół badawczy przeanalizował 60 niezależnych duplikonów i amplikonów zawierających gen ampC, pochodzących z eksperymentów ewolucji oporności na amoksycylinę. Następnie skonstruowano siedem szczepów z delecjami genów często występujących na granicach amplikonów (yjeI, ecnB, epmA, yjeM) lub genów “autostopowiczów” (sugE, blc).

Każdy mutant wraz ze szczepem dzikim (WT) poddano 22-dniowej ewolucji laboratoryjnej w obecności stopniowo rosnących stężeń amoksycyliny. Początkowe minimalne stężenie hamujące (MIC) wynosiło 4 µg/mL dla wszystkich szczepów. Eksperyment rozpoczynano od stężenia 1 µg/mL (1/4 MIC), a następnie zwiększano je co 24 godziny, gdy wzrost bakterii przy wyższym stężeniu osiągał ≥70% wzrostu przy stężeniu niższym.

Po zakończeniu ewolucji przeprowadzono sekwencjonowanie całogenomowe wszystkich wyewoluowanych szczepów. Analizowano pokrycie odczytów sekwencyjnych względem genomu referencyjnego E. coli BW25113, identyfikując regiony o zwiększonej liczbie kopii (duplikony: 1,5-2,5x; amplikony: >2,5x). Dodatkowo zidentyfikowano mutacje punktowe i warianty strukturalne genomu.

Czy istnieją preferowane granice amplifikacji ampC?

Analiza 60 amplikonów i duplikonów nie wykazała istnienia jednego, stałego punktu genomowego dla amplifikacji ampC. Najwyższą częstość punktów startowych (21%) obserwowano około 5 kb przed genem ampC, natomiast punkty końcowe najczęściej (35%) lokalizowały się około 6 kb za nim. Rozmiary amplikonów wahały się od 4 do 19 kb, podczas gdy duplikony mogły osiągać nawet 300 kb.

Wśród genów często występujących na granicach amplikonów wyróżniał się yjeM (38% przypadków, punkt końcowy) oraz yjeI (17%, punkt startowy). Nie zaobserwowano jednak liniowej zależności między rozmiarem genu a częstością jego występowania na granicy amplikonu, co sugeruje, że wielkość genu nie jest głównym czynnikiem determinującym miejsce amplifikacji.

Dwa geny – sugE (318 pz) i blc (534 pz) – były obecne w niemal wszystkich duplikonach i amplikonach jako geny “autostopowicze”. Gen sugE koduje transporter oporności wielolekowej, podczas gdy blc jest lipoproteinem zaangażowanym w transport i magazynowanie lipidów w warunkach stresowych.

Które geny wpływają na tempo rozwoju oporności?

Eksperyment ewolucyjny z mutantami delecyjnymi przyniósł kluczowe odkrycie: delecja genów sugE i epmA istotnie statystycznie obniżyła tempo adaptacji do amoksycyliny w porównaniu do szczepu dzikiego (test Wilcoxona: p=0,0094 dla ΔsugE i p=0,0265 dla ΔepmA). Oba mutanty po 22 dniach ewolucji adaptowały się do niższych stężeń amoksycyliny niż szczep WT.

Gen sugE koduje transporter z rodziny oporności wielolekowej, co bezpośrednio wiąże się z mechanizmami obronnymi komórki przed antybiotykami. EpmA (YjeA) jest lizynotransferazą czynnika wydłużania łańcucha białkowego EF-P, kluczowego dla aktywności EF-P związanej z odpornością na stres.

Mutanty ΔyjeI i ΔyjeM wykazywały nieznacznie niższe tempo adaptacji niż WT (p=0,0559 i p=0,0782), podczas gdy delecje ΔPecnB, ΔecnB i Δblc nie wpłynęły znacząco na tempo rozwoju oporności. To sugeruje, że nadekspresja sugE i epmA jako efekt ich obecności w amplikonach może ułatwiać adaptację do amoksycyliny.

Jaka jest rola elementów mobilnych w amplifikacji ampC?

Elementy transpozycyjne, szczególnie IS1, odgrywają kluczową rolę w strukturze duplikonów ampC. W badaniu stwierdzono, że IS1 uczestniczył w formowaniu granic w 9 z 27 zidentyfikowanych amplikonów lub duplikonów zawierających ampC. Co istotne, 6 z tych 9 przypadków dotyczyło konkretnie IS1A, zlokalizowanego w pozycji 19 kb genomu E. coli BW25113.

Analiza sekwencji wykazała, że IS1A konsekwentnie służył jako punkt końcowy duplikonów ampC. W trzech wyewoluowanych szczepach ΔsugE wszystkie duplikony/amplikony kończyły się w IS1A, rozpoczynając się w różnych pozycjach genomowych. Jeden ze szczepów (ΔsugE-1) wykazywał amplikon o liczbie kopii przekraczającej 200, podczas gdy dwa pozostałe prezentowały duplikację i tryplikację.

Obserwacje te wspierają model wieloetapowy, w którym duże duplikacje mediowane przez IS1 powstają początkowo, a następnie są “przycinane” do mniejszych, wysokokopiowych amplikonów ampC. Potwierdzeniem tego modelu jest wariant strukturalny ΔsugE-2, gdzie amplikon ampC bezpośrednio poprzedzał większy duplikoń kończący się w IS1A.

Większość zidentyfikowanych duplikonów, niezależnie od tego, czy były związane z ampC, wykazywała co najmniej jedno miejsce flankujące zlokalizowane w elemencie transpozonowym. Oprócz IS1, obserwowano również udział innych elementów mobilnych, takich jak IS3 i IS5, które mediowały duplikacje fragmentów o wielkości 0,31-1,09 Mb.

Jakie dodatkowe mutacje towarzyszą amplifikacji ampC?

Oprócz amplifikacji genomowej, wyewoluowane szczepy nabywały mutacje punktowe (PM) i warianty strukturalne (SV). Analiza porównawcza nie wykazała istotnych statystycznie różnic w liczbie PM i SV między szczepem dzikim a mutantami (test ANOVA). Jedynie przy użyciu testu t stwierdzono wzrost liczby PM u ΔyjeM oraz spadek SV u ΔepmA (poziom istotności 0,05).

Najczęstsze mutacje punktowe występowały w promotorze ampC (PampC), co jest zgodne z znanym mechanizmem zwiększania ekspresji poprzez delecję atenuatora promotora. Stosunkowo częste były również mutacje w genach kodujących poryny błony zewnętrznej (ompC) i ich regulatorach dwuskładnikowych (envZ, cpxA), które również przyczyniają się do oporności na beta-laktamy.

W niektórych wyewoluowanych szczepach ΔecnB i ΔPecnB zaobserwowano dodatkowe delecje w regionie upstream od ampC, o wielkości 6-211 pz. Delecje te obejmowały attenuator promotora lub całą sekwencję promotorową, co mogło dodatkowo zwiększać ekspresję ampC poprzez eliminację mechanizmów regulacyjnych.

Co te odkrycia oznaczają dla praktyki klinicznej?

Badanie dostarcza nowych informacji o molekularnych mechanizmach nabywania oporności na amoksycylinę przez E. coli, które mogą mieć znaczenie dla strategii antybiotykoterapii. Identyfikacja genów sugE i epmA jako czynników wpływających na tempo rozwoju oporności otwiera potencjalne kierunki badań nad celowanymi interwencjami.

Zrozumienie, że amplifikacja ampC nie jest ograniczona do stałego miejsca genomowego, ale często angażuje geny “autostopowicze”, wyjaśnia, dlaczego oporność może rozwijać się różnymi drogami molekularnymi u różnych szczepów. Ma to znaczenie dla interpretacji wyników diagnostyki molekularnej i przewidywania trajektorii ewolucji oporności.

Kluczowa rola elementów mobilnych, szczególnie IS1A, w kształtowaniu duplikonów ampC podkreśla znaczenie mechanizmów genetycznych wykraczających poza proste mutacje punktowe. Lekarze powinni być świadomi, że oporność może rozwijać się poprzez złożone procesy amplifikacji genomowej, co może utrudniać przewidywanie i leczenie zakażeń.

Największe potencjalne korzyści z tych odkryć mogą odnieść pacjenci z zakażeniami szczepami E. coli opornymi na beta-laktamy, szczególnie w kontekście optymalizacji dawkowania i wyboru alternatywnych strategii terapeutycznych. Konieczne są jednak dalsze badania translacyjne, w tym badania komplementacyjne potwierdzające funkcjonalną rolę zidentyfikowanych genów.

Jakie są główne wnioski z tego badania?

Badanie wykazało, że amplifikacja genu ampC u E. coli nie jest ograniczona do stałego miejsca genomowego, ale często obejmuje geny “autostopowicze”, których nadekspresja może wpływać na tempo rozwoju oporności. Delecja genów sugE i epmA istotnie obniżyła tempo adaptacji do amoksycyliny, co sugeruje ich funkcjonalną rolę w procesie nabywania oporności, chociaż wymaga to potwierdzenia w badaniach komplementacyjnych.

Element transpozycyjny IS1A konsekwentnie służył jako punkt końcowy duplikonów ampC, wspierając model wieloetapowy, w którym duże duplikacje są następnie “przycinane” do mniejszych, wysokokopiowych amplikonów. Ta obserwacja podkreśla kluczową rolę elementów mobilnych w kształtowaniu struktury genomowej związanej z opornością.

Odkrycia te rzucają nowe światło na molekularne podstawy nabywania oporności na beta-laktamy i mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia, dlaczego niektóre szczepy rozwijają oporność szybciej niż inne. Dalsze badania translacyjne są niezbędne do przełożenia tych wyników na praktyczne strategie terapeutyczne.