Liposomalna melatonina w neuroprotekcji podczas antybiotykoterapii

Czy antybiotyki mogą uszkadzać układ nerwowy?

Amoksycylina (Amx) należy do najczęściej przepisywanych antybiotyków β-laktamowych na świecie. Wykrywana jest w środowisku wodnym w stężeniach od nanogramów do mikrogramów na litr – w ściekach miejskich, odpadach szpitalnych i wodach powierzchniowych. Jej wysokie zużycie, niepełny metabolizm i trwałość w środowisku sprawiają, że stanowi priorytetowy zanieczyszczacz budzący obawy o bezpieczeństwo organizmów wodnych narażonych na długotrwałą ekspozycję.

Potencjalne działanie neurotoksyczne amoksycyliny, szczególnie na mózg, nie zostało dotychczas dokładnie zbadane. Mechanizm jej neurotoksyczności wiąże się głównie z pierścieniem laktamowym, zdolnością do przenikania przez barierę krew-mózg oraz interakcją z receptorami GABA. Interwencje terapeutyczne mające na celu łagodzenie neurotoksyczności wywołanej przez amoksycylinę są obecnie ograniczone.

Melatonina – indoloamina wytwarzana w szyszynce – odgrywa kluczową rolę w neuroprotekcji, między innymi poprzez zwiększanie poziomu kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) w ośrodkowym układzie nerwowym. Jej poziom drastycznie spada po 50. roku życia, co prowadzi do zaburzeń neurologicznych i rozwojowych. Egzogennie podawana syntetyczna melatonina jest stosowana w leczeniu zaburzeń snu związanych z nieprawidłowościami rytmu dobowego. Pełni także funkcję skutecznego zmiatacza wolnych rodników, wykazując właściwości przeciwzapalne i antyoksydacyjne.

Jak poprawić skuteczność melatoniny w ochronie mózgu?

Szybka eliminacja ustrojowa melatoniny i jej ograniczona biodostępność po podaniu doustnym lub dożylnym stanowią wyzwanie dla jej skuteczności terapeutycznej. Autorzy badania zaproponowali enkapsulację melatoniny w układzie liposomalnym opartym na kwasie 10,12-pentakozadiynowym (PCDA) i 1,2-dimirystylo-sn-glicero-3-fosfocholinie (DMPC) w celu poprawy stabilności, przedłużenia uwalniania i wzmocnienia działania neuroprotekcyjnego.

Badanie miało dwa główne cele. Po pierwsze – scharakteryzowanie enkapsulacji liposomalnej melatoniny (L-Mel) i ocenę jej skuteczności in vitro poprzez pomiar wartości IC50 oraz badanie wpływu na funkcję mitochondriów. Wykorzystano również dokowanie molekularne i symulacje komputerowe do zbadania powinowactwa wiązania amoksycyliny i melatoniny do receptora GABA, wyjaśniając ich interakcje molekularne i wpływ na przekaźnictwo neuroprzekaźnikowe. Przeprowadzono analizę Western blot w celu oceny poziomu ekspresji białek GABA w szlakach sygnałowych zmienionych przez amoksycylinę.

Po drugie – oceniono bezpieczeństwo i toksyczność L-Mel in vivo, wykorzystując rybkę pręgowaną (Danio rerio) jako organizm modelowy. Wybór ten podyktowany był wysokim podobieństwem genetycznym, neurochemicznym i fizjologicznym tego gatunku do ssaków, dobrze scharakteryzowanym układem nerwowym oraz przydatnością do ocen neurobehawioralnych i toksykologicznych.

Jak przeprowadzono badanie neuroprotekcyjnego działania L-Mel?

Melatoninę syntetyzowano w układy PCDA i DMPC w stosunku molowym 4:1, rozpuszczając je w trichlorometanie. Mieszaninę łączono z melatoniną w metanolu, a następnie odparowywano rozpuszczalnik w 45°C. Otrzymaną warstwę przemywano roztworem PBS (pH 7,2) i poddawano sonikacji przez 30 minut w temperaturze 45-50°C. Końcową mieszaninę filtrowano (0,4 μm) i wirowano w celu zebrania osadu L-Mel.

Charakterystykę L-Mel przeprowadzono za pomocą spektrofotometrii UV-Vis (zakres 300-700 nm), dynamicznego rozpraszania światła (DLS), spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), spektroskopii fotoelektronów rentgenowskich (XPS), mikroskopii optycznej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Kinetykę uwalniania melatoniny z L-Mel badano metodą dializy przez 12 godzin w roztworze PBS w 38°C.

Żywotność komórek neuronalnych kory szczura oceniano testem MTT po 48-godzinnej inkubacji z różnymi stężeniami melatoniny (1-36 mM) i L-Mel (0-100 μg/mL). Potencjał błonowy mitochondriów badano za pomocą barwnika JC-1 w grupach: 25 μM Amx, 8 mM Amx/Mel i 5 μg/mL Amx/L-Mel.

W badaniach in vivo wykorzystano zarodki i dorosłe osobniki rybek pręgowanych (n=10 w każdej grupie). Zarodki eksponowano na 100 mg/L amoksycyliny przez 96 godzin, oceniając wpływ na rozwój i aktywność lokomocyjną. Skuteczność L-Mel testowano w trzech grupach: amoksycylina w wodzie, amoksycylina z wolną melatoniną oraz amoksycylina z L-Mel. U dorosłych osobników podawano preparaty doustnie za pomocą mikropipety.

Jakie mechanizmy molekularne stoją za działaniem L-Mel?

Analiza dokowania molekularnego wykazała silne wiązanie wodorowe między amoksycyliną a receptorem GABA, obejmujące reszty aminokwasowe ASP (A:473) i GLU (A:462), z energią wiązania -6,08 kcal/mol. Melatonina wykazała konwencjonalne wiązanie wodorowe z MET (A:373) receptora GABA, z energią wiązania -5,40 kcal/mol. Analiza Ramachandrana potwierdziła, że 80% reszt aminokwasowych znajdowało się w obszarach preferowanych podczas interakcji zarówno amoksycyliny, jak i melatoniny z białkiem GABA.

Charakterystyka L-Mel wykazała szczyt absorpcji przy 301 nm w spektroskopii UV-Vis, potwierdzając skuteczną enkapsulację melatoniny. Średnica cząstek wyniosła 396 nm według DLS – wartość optymalna dla minimalizacji interakcji z białkami osocza i poprawy wchłaniania komórkowego. Spektroskopia FTIR potwierdziła obecność charakterystycznych pasm funkcyjnych: rozciąganie O-H przy 3464 cm⁻¹, rozciąganie CH₃ i CH₂ przy 2926 i 2853 cm⁻¹, rozciąganie C=O przy 1742 cm⁻¹.

Analiza XPS ujawniła, że L-Mel składa się głównie z węgla zhybrydyzowanego sp² (91,79%) z niewielką frakcją węgla sp³ (8,21%). Widmo C1s wykazało szczyt przy 284,7 eV (wiązania C=O), widmo O1s – składowe przy 532,3 eV (O-C-O) i 533,6 eV (C-OH), a widmo N1s – szczyty przy 400,6, 402,4 i 404,0 eV, potwierdzając obecność grup funkcyjnych zawierających azot.

Czy L-Mel chroni neurony przed uszkodzeniem mitochondriów?

Test MTT wykazał zależne od dawki zmniejszenie żywotności komórek po 24-godzinnej inkubacji. Analiza regresji nieliniowej określiła wartości IC50: 25,04 μM dla amoksycyliny, 7,8 mM dla melatoniny i 4,82 μg/mL dla L-Mel. Te stężenia zastosowano w dalszych eksperymentach oceniających funkcję mitochondriów.

Barwienie JC-1 ujawniło znaczące różnice w potencjale błonowym mitochondriów między grupami. Nietraktowane komórki kontrolne wykazywały wysoką czerwoną fluorescencję przy wzbudzeniu 550 nm, wskazującą na zdrowe mitochondria z wysokim potencjałem błonowym. Grupa leczona amoksycyliną wykazała znaczący wzrost liczby komórek apoptotycznych, charakteryzujących się podwyższoną zieloną fluorescencją przy 488 nm. Co istotne, grupa leczona L-Mel wykazała redukcję komórek apoptotycznych w porównaniu z grupami otrzymującymi amoksycylinę i melatoninę, co potwierdziło, że enkapsulowana L-Mel jest bardziej stabilna i skuteczna niż wolna melatonina w zapobieganiu uszkodzeniom neuronów wywołanym antybiotykiem.

Jak L-Mel wpływa na rozwój i zachowanie rybek pręgowanych?

Określenie stężenia EC50 L-Mel przeprowadzono przez ekspozycję zarodków rybek pręgowanych na stężenia 0, 2, 4, 6 i 8 mg/L przez 96 godzin. Na podstawie wyników wybrano subletalne stężenie 2 mg/L L-Mel do dalszych badań. Ekspozycja zarodków na 100 mg/L amoksycyliny przez 72 godziny prowadziła do nieprawidłowości rozwojowych, w tym przedwczesnego wykluwania się. Podanie L-Mel (2 mg/L) wraz z amoksycyliną skutkowało pełnym rozwojem zarodków bez widocznych nieprawidłowości.

Analiza aktywności lokomocyjnej larw wykazała, że ekspozycja na amoksycylinę negatywnie wpłynęła na ruchliwość. Całkowity dystans pokonany podczas 5-minutowego nagrania wyniósł 7,68 ± 1,11 cm w grupie otrzymującej amoksycylinę w porównaniu z 16,38 ± 1,17 cm w grupie kontrolnej. Jednoczesna ekspozycja na L-Mel i amoksycylinę przyniosła potencjalną poprawę lokomocji – całkowity dystans wyniósł 13,54 ± 0,63 cm.

U dorosłych rybek pręgowanych narażonych na amoksycylinę zaobserwowano znaczącą redukcję całkowitego pokonanego dystansu w porównaniu z kontrolą (p<0,0001). Jednoczesne podawanie melatoniny (Amx/Mel) lub liposomalnej melatoniny (Amx/L-Mel) skutecznie łagodziło deficyty lokomocyjne wywołane przez amoksycylinę, prowadząc do istotnej statystycznie poprawy aktywności (odpowiednio p=0,0009 i p<0,0001). Analizę wzmocniono wizualizacją map cieplnych wygenerowanych za pomocą narzędzi opartych na Pythonie, umożliwiającą porównanie wpływu poszczególnych interwencji na zachowanie eksploracyjne.

Jakie zmiany biochemiczne wywołuje L-Mel w mózgu?

Poziomy enzymów antyoksydacyjnych CAT, GST i GSH były znacząco wyższe (p<0,001) w grupie Amx/L-Mel w porównaniu z grupą otrzymującą samą amoksycylinę. Aktywność GTPx była zauważalnie zwiększona (p<0,05) w grupie Amx/L-Mel. W przypadku SOD i NO zaobserwowano istotną regulację w dół (p<0,001) w grupie Amx/L-Mel w porównaniu z grupą eksponowaną wyłącznie na amoksycylinę.

Analiza cytokin prozapalnych wykazała, że poziomy TNF-α spadły z 35,17 ± 1,04 w grupie otrzymującej amoksycylinę do 11,59 ± 1,08 w grupie Amx/L-Mel (p<0,001). Poziomy IL-1β zmniejszyły się z 18,70 ± 1,38 do 7,18 ± 0,56, a poziomy NF-κB z 24,57 ± 0,71 do 6,46 ± 0,67 (p<0,001).

Badanie histopatologiczne trzech różnych narządów – mózgu, wątroby i jelit dorosłych rybek – wykazało, że grupy eksponowane na amoksycylinę wykazywały uszkodzenia tkanek we wszystkich trzech narządach, szczególnie w mózgu. Ryby otrzymujące Amx/L-Mel wykazały mniejsze uszkodzenia tkanek, zwłaszcza w mózgu, w porównaniu z innymi narządami. Znaczącą zmianą była redukcja martwicy.

Czy L-Mel moduluje ekspresję genów związanych z pamięcią?

Analiza ekspresji genów wykazała, że poziom BDNF był zauważalnie wyższy (p<0,05) w grupie Amx/L-Mel niż w grupie otrzymującej samą amoksycylinę. Odnotowano znaczący wzrost (p<0,01) poziomów CREBBP i ASCL w grupie Amx/L-Mel w porównaniu z grupą eksponowaną wyłącznie na amoksycylinę. W przeciwieństwie do wymienionych wcześniej genów, poziomy NF-κB były zauważalnie obniżone (p<0,01) w grupie Amx/L-Mel w porównaniu z grupą otrzymującą amoksycylinę.

BDNF odgrywa kluczową rolę w przeżyciu i wzroście neuronów, działa jako modulator neuroprzekaźników i przyczynia się do plastyczności neuronalnej – istotnego składnika procesów pamięci i poznania. CREBBP jest kluczowy dla regulacji podziału i proliferacji komórek oraz indukcji dojrzewania komórek. ASCL jest kluczowym regulatorem neurogenezy w mózgu ssaków. NF-κB zapewnia prawidłowe funkcjonowanie neuronów, promuje wzrost synaps i wspiera funkcje związane z plastycznością.

Mapa cieplna wygenerowana dla genów kandydujących za pomocą oprogramowania SR-Plot ilustrowała dwukierunkowy klaster genów, pokazując odległość euklidesową wzoru ekspresji genów docelowych. Kolor niebieski reprezentował niższe wartości, podczas gdy czerwony – wyższe wartości.

Jak L-Mel wpływa na równowagę GABA i glutaminianu?

Analiza HPLC wykazała, że grupa otrzymująca amoksycylinę wykazywała zmniejszony czas retencji GABA (Rt-Amx: 19,63) i zwiększony czas retencji glutaminianu (Rt-Amx: 22,58) w porównaniu z grupą kontrolną (Rt-GABA: 19,96, Rt-Glutaminian: 20,58). Grupa Amx/L-Mel wykazała znacząco zwiększony czas retencji GABA [Rt (Amx/L-Mel): 19,89] i zmniejszony czas retencji glutaminianu [Rt (Amx/L-Mel): 21,45] w porównaniu z grupą otrzymującą samą amoksycylinę.

Wzrost poziomu glutaminianu – aminokwasu pobudzającego – jest silnie powiązany z rozwojem zaburzeń neurologicznych. Badanie wykazało znaczącą regulację w górę poziomów GABA i odpowiadającą jej regulację w dół poziomów glutaminianu w tkance mózgowej rybek pręgowanych leczonych L-Mel.

Aktywność acetylocholinoesterazy (AChE) w mózgach dorosłych rybek pręgowanych wykazała znaczne podwyższenie w grupie otrzymującej amoksycylinę w porównaniu z grupą kontrolną, wskazując na zwiększony obrót cholinergiczny. Grupa Amx/L-Mel wykazała wyraźną redukcję w kierunku poziomów wyjściowych, sugerując ochronną rolę w utrzymaniu równowagi cholinergicznej.

Analiza Western blot oceniająca ekspresję białka docelowego (receptor GABA-A γ2) wykazała, że grupa kontrolna wykazywała najwyższą ekspresję w porównaniu z grupą otrzymującą amoksycylinę. Grupa Amx/L-Mel wykazała znaczący wzrost ekspresji receptora GABA-A γ2 w przeciwieństwie do warunków samej amoksycyliny i połączenia Amx/Mel (p<0,05).

Czy można śledzić L-Mel w organizmie żywym?

Obrazowanie in vivo rybek pręgowanych, którym doustnie podano amoksycylinę-rodaminę oraz kombinację Amx/Mel i Amx/L-Mel-rodaminy, pozwoliło na śledzenie działania nanoformulowanego leku (L-Mel) w mózgu rybek. Po 4 godzinach od podania zaobserwowano intensywność fluorescencji w regionie otrzewnowym rybek we wszystkich grupach.

Po 12 godzinach od podania fluorescencję zaobserwowano tylko w regionie głowy ryb otrzymujących amoksycylinę oraz w regionach głowy i otrzewnej ryb otrzymujących Amx/Mel i Amx/L-Mel. Co ciekawe, w grupie Amx/Mel emisja fluorescencyjna była niższa niż w grupie Amx/L-Mel, wskazując, że nanoformulowany lek (L-Mel) utrzymywał się w krążeniu przez dłuższy czas niż surowa melatonina. To wskazuje, że L-Mel pozostaje w krążeniu wraz z amoksycyliną, aby łagodzić uszkodzenia wywołane przez antybiotyk w mózgu.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej?

Badanie dostarcza przekonujących dowodów na neuroprotekcyjne działanie liposomalnej melatoniny przeciwko neurotoksyczności wywołanej amoksycyliną. Nanoformulacja wykazała lepszą stabilność, przedłużone uwalnianie i większą skuteczność w porównaniu z wolną melatoniną. Mechanizm działania obejmuje redukcję stresu oksydacyjnego, modulację cytokin prozapalnych, przywrócenie równowagi neuroprzekaźników oraz ochronę funkcji mitochondriów.

Dla praktyków klinicznych szczególnie istotne może być potencjalne zastosowanie L-Mel u pacjentów poddawanych długotrwałej antybiotykoterapii, zwłaszcza w populacji osób starszych z obniżonym poziomem endogennej melatoniny. Strategia ta może być szczególnie wartościowa w przypadkach, gdy konieczne jest stosowanie wysokich dawek β-laktamów lub u pacjentów z czynnikami ryzyka powikłań neurologicznych.

Należy jednak podkreślić, że są to badania prekliniczne przeprowadzone na modelu rybki pręgowanej. Konieczne są dalsze badania translacyjne w celu potwierdzenia skuteczności i bezpieczeństwa u ludzi. Wymaga to również optymalizacji drogi podania, dawkowania oraz oceny potencjalnych interakcji z innymi lekami stosowanymi w praktyce klinicznej.

„Nasze badanie wykazuje, że nanoformulowana L-Mel jest obiecującą cząsteczką do rozwiązywania problemów neurologicznych wywołanych antybiotykami” – piszą autorzy badania, zaznaczając jednocześnie potrzebę dalszych badań preklinicznych w celu walidacji rozszerzonych korzyści terapeutycznych L-Mel w leczeniu neuroinflammacji i zaburzeń behawioralnych wywołanych antybiotykami.

Czy nanoformulacja melatoniny może zmienić podejście do antybiotykoterapii?

Liposomalna enkapsulacja melatoniny w układzie PCDA-DMPC skutecznie poprawia stabilność i przedłuża uwalnianie leku, co potwierdzono zarówno w warunkach ex vivo, jak i in vivo. Analiza komputerowa wykazała specyficzne wiązanie zarówno amoksycyliny, jak i melatoniny z receptorem GABA, wyjaśniając molekularny mechanizm działania. L-Mel skutecznie hamuje nieprawidłowości rozwojowe wywołane przez amoksycylinę i reguluje parametry behawioralne oraz poziomy antyoksydantów w modelach in vitro i in vivo. Kluczowym odkryciem jest zdolność L-Mel do modulacji poziomów neuroprzekaźników – zwiększenia GABA przy jednoczesnym zmniejszeniu glutaminianu – oraz łagodzenia degeneracji neuronów podczas uszkodzeń mózgu wywołanych przez amoksycylinę. Potwierdza to potencjał terapeutyczny nanoformulowanej melatoniny w adresowaniu problemów neurologicznych związanych z antybiotykoterapią. Mimo obiecujących wyników, konieczne są dalsze badania prekliniczne w celu pełnej walidacji tej strategii terapeutycznej przed przeniesieniem do praktyki klinicznej.