Nanocząstki magnetyczne przełamują oporność MRSA na antybiotyki

Czy nanocząstki mogą przełamać oporność MRSA?

Badanie przedstawione w artykule dotyczy nowatorskiego podejścia do zwalczania opornych na metycylinę szczepów Staphylococcus aureus (MRSA) poprzez zastosowanie nanocząstek magnetycznych jako nośników amoksycyliny. Autorzy zastosowali połączenie metod eksperymentalnych i obliczeniowych w celu oceny skuteczności oraz mechanizmu działania tego rozwiązania.

MRSA stanowi rosnące zagrożenie dla zdrowia publicznego, powodując około 94 000 inwazyjnych zakażeń rocznie tylko w USA, ze znacznie wyższą śmiertelnością niż szczepy wrażliwe na metycylinę. Oporność MRSA wynika głównie z obecności białka PBP2a (kodowanego przez gen mecA), które wykazuje niskie powinowactwo do antybiotyków β-laktamowych, umożliwiając ciągłe sieciowanie peptydoglikanu podczas syntezy ściany komórkowej pomimo obecności antybiotyku. Oporność jest dodatkowo wzmacniana przez integrację ruchomych elementów genetycznych, takich jak kaseta chromosomowa SCCmec, produkcję β-laktamaz oraz zmiany w strukturze i przepuszczalności ściany komórkowej.

Jak skutecznie wytwarzamy nanocząstki jako nośniki amoksycyliny?

Badacze zsyntetyzowali magnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (Fe₃O₄) pokryte powłoką krzemionkową (SiO₂), do których następnie przyłączono amoksycylinę. Synteza nanocząstek Fe₃O₄ została przeprowadzona metodą współstrącania, w której chlorek żelaza(III) i chlorek żelaza(II) połączono w stosunku molowym 2:1 przy energicznym mieszaniu w temperaturze 25°C. Wodorotlenek amonu dodawano kroplami do osiągnięcia pH 10-11, co skutkowało natychmiastowym powstaniem czarnego osadu. Osad wielokrotnie przemywano 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną. Oczyszczony osad suszono próżniowo przez noc w temperaturze 60°C, a następnie rozpraszano w mieszaninie etanol-woda (3:1) zawierającej 10% ortokrzemianu tetraetylu (TEOS) przy pH 9,0. Ogrzewanie tej dyspersji do 90°C przez 6 godzin indukowało proces Stöbera, prowadząc do równomiernego pokrycia rdzeni magnetytu powłoką krzemionkową.

Charakterystyka fizykochemiczna wykazała, że otrzymane nanocząstki amoksycylina-MNPs posiadały ujemny potencjał zeta (−24,9 ± 4,18 mV), co zapewniało stabilność koloidalną, oraz średni rozmiar hydrodynamiczny 335,5 nm przy indeksie polidyspersyjności 0,30. Obrazowanie TEM uwidoczniło sferyczne rdzenie o średnicy 6-8 nm, a spektroskopia UV-Vis potwierdziła skuteczną koniugację amoksycyliny poprzez zaobserwowanie batochromowego przesunięcia piku do około 275,6 nm, wraz z efektem hiperchromowym (zwiększona intensywność absorbancji) w regionie 220-300 nm.

Czy nanocząstki zwiększają działanie antybiotyku?

Badanie aktywności przeciwbakteryjnej przeprowadzono metodą dyfuzji w agarze przeciwko Staphylococcus aureus ATCC 43300. Wyniki wykazały, że amoksycylina koniugowana z nanocząstkami magnetycznymi wykazywała znacząco większą skuteczność niż wolna amoksycylina. Średnica strefy zahamowania wzrostu dla amoksycylina-MNPs wynosiła 26,0 ± 0,82 mm, prawie dwukrotnie więcej niż w przypadku wolnej amoksycyliny przy równoważnym stężeniu (13,5 ± 1,12 mm). Różnica była statystycznie istotna (p = 0,028 w teście Wilcoxona i p = 0,0305 w teście permutacyjnym).

Zwiększoną skuteczność przypisano kilku czynnikom związanym z nanocząstkami: zwiększonemu lokalnemu stężeniu antybiotyku na powierzchni komórek bakteryjnych, ochronie niestabilnego pierścienia β-laktamowego przed degradacją przez β-laktamazy oraz prawdopodobnie zwiększonej penetracji przez ścianę komórkową bakterii. Pomimo ujemnego ładunku nanocząstkami i przeważnie ujemnie naładowanej powierzchni ścian komórkowych bakterii, interakcja jest możliwa dzięki lokalnym mikrodomenom o zróżnicowanym rozkładzie ładunku, oddziaływaniom nieelektrostatycznym (van der Waalsa, hydrofobowym) oraz wysokiemu stosunkowi powierzchni do objętości nanocząstek.

Jak amoksycylina wiąże się z PBP1a?

Równolegle przeprowadzono analizę in silico, badając mechanizm molekularny wiązania amoksycyliny do białka wiążącego penicylinę 1a (PBP1a) – alternatywnego celu w MRSA. Analiza strukturalna PBP1a wykazała trójdzielną organizację domen: domenę dimeryzacji PBP na N-końcu (reszty 26-189), domenę transpeptydazową w regionie centralnym (reszty 234-544) odpowiedzialną za sieciowanie peptydoglikanu, oraz C-końcową domenę (reszty 554-573) zidentyfikowaną jako segment nieuporządkowany.

Dokowanie molekularne przewidywało korzystne wiązanie amoksycyliny do PBP1a z energią wiązania −8,640 kcal/mol. Zidentyfikowano sieć interakcji stabilizujących kompleks, w tym oddziaływania hydrofobowe z resztami Trp351, Thr516 i Tyr534 oraz osiem wiązań wodorowych z resztami Ser314, Ser368, Asn370, Lys513, Thr516, Tyr534 i Tyr566. Szczególnie silne wiązania wodorowe zaobserwowano z Asn370 (odległość H-A 2,26 Å) i Ser368 (odległość H-A 2,42 Å).

Jak potwierdzono stabilność i przyszłe zastosowania terapii?

Symulacje dynamiki molekularnej (100 ns) potwierdziły stabilność kompleksu amoksycylina-PBP1a. Analiza RMSD wykazała trzyfazowy proces adaptacji konformacyjnej: początkowe dostosowanie (0-15 ns) z wartościami RMSD wzrastającymi od ~0,06 nm do ~0,48 nm, przejście z większymi fluktuacjami (15-25 ns) z RMSD wahającym się od ~0,24 do ~0,64 nm, i dynamiczną równowagę (25-100 ns) z wartościami RMSD oscylującymi między ~0,27 a 0,65 nm.

Analiza promienia żyracji (Rg) potwierdziła zachowanie ogólnej integralności strukturalnej PBP1a, z wartościami pozostającymi w wąskim zakresie ~2,80 do ~3,05 nm. Pomiary powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika (SASA) wykazały ograniczone fluktuacje w zakresie ~230,9-254,6 nm², wskazując na spójną ekspozycję kompleksu na rozpuszczalnik. Analiza funkcji rozkładu radialnego (RDF) potwierdziła istnienie specyficznych interakcji między amoksycyliną a PBP1a, z ostrym pikiem przy r ≈ 1,04 nm i g(r) ≈ 12,8.

Analiza wiązań wodorowych wykazała dynamiczny wzorzec interakcji, z liczbą wiązań wodorowych wahającą się potencjalnie od 0 do 8, przy czym większość symulacji prawdopodobnie wykazywała 2-5 jednoczesnych wiązań wodorowych. Analiza RMSF ujawniła regiony o zwiększonej elastyczności, szczególnie w resztach 100-150, gdzie wartości RMSF osiągnęły maksimum 0,641 nm. Analiza struktury drugorzędowej wykazała, że białko w dużej mierze zachowało swoją integralność strukturalną przez cały okres symulacji, z przewagą struktur typu coil (46,92%), struktur α-helikalnych (31,11%) i β-kartek (21,98%).

Obliczenia energii swobodnej wiązania metodą MM-PBSA wykazały silne powinowactwo amoksycyliny do PBP1a ze średnią całkowitą energią wiązania −32,65 kcal/mol (SD = 5,17 kcal/mol). Główne wkłady pochodziły z energii van der Waalsa (−37,82 kcal/mol) i oddziaływań elektrostatycznych (−46,91 kcal/mol), co zrównoważyło dodatnią energię solwatacji polarnej (57,84 kcal/mol). Analiza energetyczna poszczególnych reszt wykazała, że reszty takie jak Trp351 (−4,15 kcal/mol), Thr516 (−1,71 kcal/mol), Gln425 (−1,39 kcal/mol) i Ser314 (−1,25 kcal/mol) mają znaczący udział w stabilizacji kompleksu.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na wykorzystaniu nanocząstek magnetycznych jako nośników amoksycyliny w walce z MRSA. Naukowcy zsyntezowali magnetyczne nanocząstki tlenku żelaza pokryte powłoką krzemionkową, do których przyłączono amoksycylinę. Otrzymane nanocząstki wykazały znaczącą skuteczność przeciwbakteryjną – strefa zahamowania wzrostu była prawie dwukrotnie większa niż w przypadku wolnej amoksycyliny. Zwiększoną skuteczność przypisano wyższemu lokalnemu stężeniu antybiotyku na powierzchni komórek bakteryjnych, ochronie pierścienia β-laktamowego oraz lepszej penetracji przez ścianę komórkową bakterii. Analiza in silico potwierdziła stabilne wiązanie amoksycyliny do białka PBP1a, z korzystną energią wiązania i siecią stabilizujących interakcji molekularnych. Symulacje dynamiki molekularnej wykazały trwałość kompleksu i zachowanie jego integralności strukturalnej, co potwierdza potencjał tej innowacyjnej metody w terapii zakażeń MRSA.