Nowa metoda LC-MS/MS w badaniach klinicznych – przełom w oznaczaniu antybiotyków

Jak nowa metoda LC-MS/MS wpływa na badania kliniczne?

Badanie przedstawia nową metodę LC-MS/MS do jednoczesnego oznaczania amoksycyliny i kwasu klawulanowego w osoczu ludzkim. Jest to badanie analityczne, które miało na celu opracowanie i walidację czułej metody chromatograficznej do oznaczania tych dwóch składników popularnego antybiotyku Augmentin^®.

Badana populacja obejmowała siedemnastu zdrowych koreańskich ochotników (dwunastu mężczyzn i pięć kobiet) w wieku 19-50 lat, z BMI 17,5-30,5 kg/m². Uczestnicy z historią nadwrażliwości na amoksycylinę/kwas klawulanowy i antybiotyki β-laktamowe zostali wykluczeni z badania. Wszyscy uczestnicy otrzymali pojedynczą dawkę tabletki Augmentin^® IR (250/125 mg) z 240 ml wody w stanie na czczo.

Jak opracowano i zwalidowano metodę LC-MS/MS?

Opracowana metoda analityczna wykorzystuje technikę LC-MS/MS (chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas) do jednoczesnego oznaczania amoksycyliny i kwasu klawulanowego w osoczu ludzkim. Kluczowym elementem metody jest uproszczone przygotowanie próbki, które obejmuje deproteinizację acetonitrylem, a następnie ekstrakcję wsteczną przy użyciu wody destylowanej i dichlorometanu. Metoda została w pełni zwalidowana zgodnie z wytycznymi amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Międzynarodowej Rady Harmonizacji Wymagań Technicznych dla Rejestracji Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (ICH). Dolne granice oznaczalności (LLOQ) wynosiły 10 ng/ml dla amoksycyliny i 20 ng/ml dla kwasu klawulanowego, co jest wystarczające do monitorowania stężeń terapeutycznych. Metoda wykazała doskonałą liniowość w zakresie stężeń 10-15 000 ng/ml dla amoksycyliny i 20-10 000 ng/ml dla kwasu klawulanowego.

Szczegółowa optymalizacja parametrów LC-MS/MS obejmowała dobór odpowiednich warunków jonizacji, gdzie jony prekursorowe [M − H]⁻ przy m/z 363,9 dla amoksycyliny, m/z 198,0 dla kwasu klawulanowego i m/z 285,0 dla wzorca wewnętrznego (4-hydroksytolbutamid) zostały wybrane w trybie MS/MS. Metoda wykorzystuje kolumnę Poroshell 120 EC-C₁₈ (100 × 4,6 mm, 2,7 μm) z gradientową fazą ruchomą składającą się z 0,1% wodnego kwasu mrówkowego i acetonitrylu przy przepływie 0,50 ml/min, co pozwala na elucję wszystkich analitów w czasie krótszym niż 5 minut.

Dodatkowo, metoda została częściowo zwalidowana dla różnych antykoagulantów (heparyna litowa, heparyna sodowa i K₃-EDTA), co zwiększa jej użyteczność w badaniach wieloośrodkowych. Wszystkie testowane antykoagulanty spełniały akceptowalne limity dokładności (±15% RE) i precyzji (≤15% RSD), co potwierdza, że różne rodzaje próbek osocza mogą być stosowane zamiennie w badaniach farmakokinetycznych.

Badanie stabilności wykazało, że roztwory podstawowe amoksycyliny i kwasu klawulanowego są stabilne przez 60 dni w temperaturze -80°C, 4 godziny w temperaturze pokojowej i 24 godziny w temperaturze 4°C. Jednak roztwór podstawowy kwasu klawulanowego ulegał degradacji po 6 godzinach przechowywania w temperaturze pokojowej, co jest istotną informacją dla laboratoriów analitycznych.

Jakie są kliniczne implikacje i zalety zastosowania tej metody?

Wyniki badania farmakokinetycznego wykazały, że amoksycylina i kwas klawulanowy osiągają maksymalne stężenie w osoczu (C_max) po około 1,5 godziny od podania (mediana T_max). Średnie wartości C_max wynosiły 5050 ± 1150 ng/ml dla amoksycyliny i 2430 ± 1070 ng/ml dla kwasu klawulanowego. Średnie wartości AUC_t (pole pod krzywą stężenie-czas) wynosiły 12 200 ± 2240 ng·h/ml dla amoksycyliny i 5630 ± 2660 ng·h/ml dla kwasu klawulanowego. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w parametrach farmakokinetycznych między mężczyznami a kobietami.

Co istotne, badanie wykazało znaczną zmienność międzyosobniczą w parametrach farmakokinetycznych kwasu klawulanowego wśród zdrowych koreańskich ochotników. Współczynnik zmienności (CV) dla kwasu klawulanowego wynosił 43,9% dla C_max i 47,2% dla AUC_t, podczas gdy dla amoksycyliny wynosił odpowiednio 22,7% i 18,2%. Zgodnie z kryteriami Al-Sallamiego i wsp., kwas klawulanowy można uznać za lek o wysokiej zmienności farmakokinetycznej (CV% > 40%). Wysoka zmienność międzyosobnicza w absorpcji kwasu klawulanowego była również raportowana w innych badaniach klinicznych z udziałem zdrowych ochotników.

Opracowana metoda analityczna ma szereg zalet w porównaniu do wcześniej opisanych metod. Przede wszystkim, wykorzystuje małą objętość osocza (100 μl), co jest korzystne w badaniach klinicznych. Ponadto, metoda charakteryzuje się krótkim czasem analizy (< 6,5 min/próbkę), co umożliwia wysoką przepustowość w rutynowych analizach bioanalitycznych. Dodatkowo, metoda jest przyjazna dla środowiska, co zostało potwierdzone przy użyciu narzędzia oceny ekologiczności AGREE.

Wyniki badania mają istotne implikacje kliniczne. Wysoka zmienność międzyosobnicza w farmakokinetyce kwasu klawulanowego sugeruje, że przy projektowaniu badań interakcji lekowych z użyciem Augmentinu^® należy uwzględnić tę zmienność, co może wpłynąć na szacowanie odpowiedniej wielkości próby i optymalizację punktów pobierania krwi. Ponadto, metoda ta może być stosowana do monitorowania stężeń terapeutycznych amoksycyliny i kwasu klawulanowego u pacjentów, co może pomóc w optymalizacji dawkowania i poprawie skuteczności leczenia.

Warto podkreślić, że opracowana metoda może być stosowana do analizy próbek z badań z wyższymi dawkami Augmentinu^® (np. 500/125 mg lub 875/125 mg), które są często stosowane w praktyce klinicznej. Biorąc pod uwagę, że amoksycylina wykazuje nieliniową farmakokinetykę z powodu nasycenia wchłaniania po podaniu doustnym, obecna metoda jest prawdopodobnie odpowiednia do oznaczania szerokiego zakresu dawek klinicznych w obrębie zwalidowanego zakresu kalibracji.

Opracowana metoda LC-MS/MS stanowi cenne narzędzie analityczne do jednoczesnego oznaczania amoksycyliny i kwasu klawulanowego w osoczu ludzkim. Metoda ta może znaleźć zastosowanie w badaniach farmakokinetycznych, badaniach interakcji lekowych oraz w monitorowaniu terapii antybiotykowej. Wysoka zmienność międzyosobnicza w farmakokinetyce kwasu klawulanowego podkreśla znaczenie indywidualnego podejścia do dawkowania Augmentinu^® w praktyce klinicznej.

Podsumowanie

Opracowano nową metodę LC-MS/MS do jednoczesnego oznaczania amoksycyliny i kwasu klawulanowego w osoczu ludzkim, którą przetestowano na siedemnastu zdrowych koreańskich ochotnikach. Metoda wykorzystuje uproszczone przygotowanie próbki poprzez deproteinizację acetonitrylem i ekstrakcję wsteczną. Charakteryzuje się wysoką czułością z dolnymi granicami oznaczalności 10 ng/ml dla amoksycyliny i 20 ng/ml dla kwasu klawulanowego. Badanie wykazało znaczną zmienność międzyosobniczą w parametrach farmakokinetycznych kwasu klawulanowego, co ma istotne znaczenie przy projektowaniu badań klinicznych. Metoda jest wydajna, ekologiczna i może być stosowana do monitorowania stężeń terapeutycznych oraz w badaniach farmakokinetycznych różnych dawek Augmentinu. Jej główne zalety to wykorzystanie małej objętości osocza (100 μl) oraz krótki czas analizy (poniżej 6,5 min/próbkę).