Jakie nowe mechanizmy kształtują oporność E. coli na amoksycylinę?
Najnowsze badania nad adaptacją Escherichia coli do amoksycyliny ujawniają zaskakujące mechanizmy nabywania oporności bakteryjnej. Naukowcy z zaskoczeniem odkryli, że usunięcie genów dinB i katE, uznawanych dotychczas za kluczowe w rozwoju oporności na beta-laktamy, nie wpłynęło negatywnie na zdolność bakterii do adaptacji do amoksycyliny. Odkrycie to podważa dotychczasowe przekonania na temat mechanizmów oporności bakteryjnej i otwiera nowe perspektywy badawcze.
W przeprowadzonym eksperymencie porównano szczep dzikiego typu E. coli MG1655 z mutantami pozbawionymi genów dinB (kodującego polimerazę DNA IV) i katE (kodującego katalazę HP2). Wbrew oczekiwaniom, wszystkie trzy szczepy wykazały podobne tempo adaptacji do rosnących stężeń amoksycyliny. Sekwencjonowanie całego genomu po adaptacji ujawniło, że szczepy nabyły podobny zestaw mutacji, częściowo pokrywających się, a nawet identycznych. Szczególnie istotne okazały się mutacje w regionie operonu ampC oraz w genie frdD, które wpływają na ekspresję beta-laktamazy.
Zaobserwowano również amplifikację regionu genomowego zawierającego gen ampC oraz kilka innych genów, w tym blc, gdx, ecnA, ecnB, efp i epmA. Część tego regionu została wcześniej opisana jako potencjalny region transpozonowy, który może być przekazywany między komórkami E. coli. Wszystkie trzy szczepy wykazały znaczącą nadekspresję ampC na końcu eksperymentu ewolucyjnego, co potwierdza kluczową rolę tego genu w oporności na beta-laktamy.
Czy genetyczne rewolucje zmieniają reguły gry?
Najbardziej intrygującym odkryciem była mutacja w genie rpoD, kodującym czynnik sigma 70, która pojawiła się w dwóch replikatach ΔkatE, dwóch replikatach ΔdinB i jednym replikacie MG1655. Ta mutacja (D445V) występuje w wysoko konserwowanym regionie 2 czynnika sigma 70, który jest kluczowy zarówno dla wiązania DNA (rozpoznawanie promotora -10), jak i wiązania polimerazy RNA. Przewidywania strukturalne sugerują, że mutacja D445V powoduje utratę licznych wiązań z sąsiednimi aminokwasami, co może wpływać na zdolność czynnika sigma do wiązania się z polimerazą RNA i rozpoznawania promotorów.
Analiza transkryptomiczna ujawniła, że delecja genów dinB i katE doprowadziła do odrębnych zmian w ekspresji genów w porównaniu z dzikim typem. W mutancie ΔdinB zaobserwowano znaczącą regulację w dół genów związanych z bezbłędną i podatną na błędy syntezą translesion. Z kolei mutant ΔkatE wykazał obniżoną regulację procesów katabolicznych i metabolicznych nadtlenku wodoru, jednak efekt ten był mniej wyraźny niż wpływ obserwowany w przypadku ΔdinB. Sugeruje to, że podczas gdy katE jest zaangażowany w zarządzanie stresem oksydacyjnym, inne szlaki mogą częściowo kompensować jego nieobecność.
Zaobserwowano również znaczące zmiany w systemie toksyna-antytoksyna prlF/yhaV. Mutanty ΔdinB i ΔkatE wykazały obniżoną ekspresję prlF i yhaV w porównaniu z ewoluowanym dzikim typem. System ten może odgrywać rolę w nabywaniu oporności na antybiotyki poprzez wpływ na ekspresję ompF (poryny zaangażowanej w pobieranie beta-laktamów) oraz przez wywoływanie odwracalnej bakteriostazy, co może pośrednio wpływać na skuteczność amoksycyliny.
Jak ewolucyjny eksperyment ujawnia dynamikę adaptacji?
Eksperyment ewolucyjny przeprowadzono w taki sposób, że początkowa ekspozycja bakterii na amoksycylinę rozpoczęła się od stężenia 2 μg/mL, co odpowiadało ¼ MIC dla wszystkich szczepów. Po nocnej inkubacji, jeśli gęstość optyczna (OD600) przekraczała 65% OD600 poprzedniej hodowli, stężenie amoksycyliny podwajano w świeżym medium. Eksperyment zakończono, gdy hodowla osiągnęła i tolerowała stężenie amoksycyliny 1024 μg/mL przez wiele dni. Warto podkreślić, że wszystkie szczepy wykazały jednolite tempo adaptacji aż do klinicznego progu oporności wynoszącego 8 μg/mL i powyżej.
W szczepie dzikiego typu MG1655, najistotniejsza regulacja w dół w transkryptomie została zaobserwowana w genach waaB (synteza LPS, zaangażowana w inwazję gospodarza), asnA (syntetaza asparaginy) i gstB (stres oksydacyjny), wraz ze znaczącą regulacją w górę mdtK (pompa usuwająca wiele leków) i yhaV (toksyna systemu toksyna-antytoksyna YhaV-PrlF). Szczep ΔdinB wykazał znaczącą regulację w dół alaE (eksporter alaniny), tatE (transport złożonych białek, czynnik wirulencji) i hdeA (odpowiedź na stres kwasowy), z regulacją w górę panB (szlak biosyntezy kwasu pantotenowego, związany z opornością w Edwardsiella tarda) i efp (czynnik elongacji, synteza wiązań peptydowych).
- Wbrew wcześniejszym teoriom, usunięcie genów dinB i katE nie hamuje rozwoju oporności na amoksycylinę
- Zidentyfikowano nową mutację D445V w genie rpoD, która znacząco zwiększa oporność na beta-laktamy
- Bakterie osiągają oporność na bardzo wysokie stężenia amoksycyliny (do 1024 μg/mL) niezależnie od obecności genów dinB i katE
- Amplifikacja regionu genomowego zawierającego gen ampC oraz mutacje w genie frdD to kluczowe mechanizmy adaptacyjne
Czy zmiany w genomie to klucz do metabolicznej elastyczności?
Badania nad rolą frdD wykazały, że gen ten jest stale regulowany w górę w odpowiedzi na ekspozycję na amoksycylinę, nawet w szczepach, które już zaadaptowały się do antybiotyku. Natomiast transkrypcja ampC pozostała niezmieniona po ekspozycji na amoksycylinę w tych zaadaptowanych komórkach. Sugeruje to bardziej złożoną rolę fumaranu w adaptacji do amoksycyliny, wykraczającą poza regulację ampC. Gen frdD jest integralną częścią beztlenowego oddychania u bakterii, a skuteczność antybiotyków beta-laktamowych jest powiązana z oddychaniem bakteryjnym.
Ponadto, frdD może być bezpośrednio zaangażowany w adaptację do beta-laktamów jako mediator elastyczności metabolicznej w warunkach stresu. Fumaran służy jako alternatywny akceptor elektronów w warunkach beztlenowych i jest redukowany do bursztynianu przez reduktazę fumaranu. W pewnych warunkach reduktaza fumaranu może zastąpić dehydrogenazę bursztynianową, składnik kompleksu II w oddychaniu tlenowym, który uczestniczy również w cyklu Krebsa. Ta substytucja może odzwierciedlać adaptację metaboliczną do różnych warunków wzrostu, ponieważ reduktaza fumaranu jest związana z wyższą produkcją anionu ponadtlenkowego niż dehydrogenaza bursztynianowa.
Mutacja D445V w rpoD została niedawno opisana w literaturze w badaniu dotyczącym szczepu E. coli związanego z chorobą Crohna. Wykazano, że nie wpływa ona na aktywność katalityczną polimerazy RNA (RNAP), ale wpływa na geny związane z kolonizacją jelit i opornością na beta-laktamy. Badanie wykazało zmiany transkryptomiczne w kluczowych genach, w tym ampC, odpowiedniku ROS yggE i regulatorze rpoS – rprA. Co istotne, D445V było wystarczające, aby uczynić wcześniej wrażliwy szczep opornym na pięć beta-laktamów i zwiększyć oporność na inne testowane antybiotyki, takie jak cyprofloksacyna.
Biorąc pod uwagę pozycję mutacji D445V w regionie 2 i przewidywane zmiany w strukturze białka, wydaje się prawdopodobne, że mutacja ta wpływa na zdolność czynnika sigma do wiązania się z polimerazą RNA. RpoD i RpoS (Sigma 30) dzielą kilka miejsc wiązania i konkurują o RNAP. Mutacja D445V może zwiększać powinowactwo RpoD do wiązania się z RNAP, dając mu przewagę nad RpoS. Rzeczywiście, wcześniej opisany mutant D445V wykazywał niższe poziomy sigma S. Chociaż może się wydawać nielogiczne hamowanie RpoS, czynnika sigma odpowiedzialnego za ogólną odpowiedź na stres w E. coli, zwłaszcza ze względu na jego zaangażowanie w mutagenezę indukowaną antybiotykami, strategia ta może sprzyjać przeżyciu bakterii w określonych warunkach, gdzie utrzymanie sprawności przeważa nad potrzebą szerokiej odpowiedzi na stres.
- Odkrycie nowych mechanizmów oporności wymaga rewizji dotychczasowych strategii leczenia
- Zidentyfikowane mutacje mogą służyć jako markery diagnostyczne oporności na antybiotyki
- Bakterie posiadają redundantne mechanizmy oporności, co utrudnia ich zwalczanie
- System toksyna-antytoksyna prlF/yhaV może być potencjalnym celem terapeutycznym
- Konieczne jest monitorowanie nowych mutacji w genach rpoD i frdD podczas terapii antybiotykowej
Jak wyniki badań przekładają się na praktykę kliniczną?
Badania te rzucają nowe światło na złożone mechanizmy adaptacji bakterii do antybiotyków beta-laktamowych. Sugerują, że bakterie posiadają różnorodne i redundantne mechanizmy oporności, które mogą być aktywowane w odpowiedzi na presję selekcyjną antybiotyków. Recurrent mutacje w frdD i operonie ampC wskazują na kluczową rolę regulacyjną frdD w oporności na beta-laktamy. Mutacja w rpoD sugeruje istotną funkcję regulacyjną tego czynnika sigma w warunkach stresu antybiotykowego.
Wyniki te mają istotne implikacje kliniczne, gdyż lepsze zrozumienie mechanizmów adaptacji bakterii do antybiotyków może pomóc w opracowaniu skuteczniejszych strategii leczenia infekcji bakteryjnych oraz w monitorowaniu i zapobieganiu rozwojowi oporności. Ponadto, zidentyfikowane mutacje mogą służyć jako markery molekularne oporności na beta-laktamy w diagnostyce klinicznej.
Badanie to podkreśla również znaczenie podejścia integracyjnego w badaniu mechanizmów adaptacyjnych bakterii, łączącego analizę genomiczną, transkryptomiczną i strukturalną w celu uzyskania pełniejszego obrazu złożonych procesów biologicznych leżących u podstaw oporności na antybiotyki.
Podsumowanie
\- Usunięcie genów dinB i katE, uznawanych za kluczowe w rozwoju oporności na beta-laktamy, nie wpłynęło na zdolność E. coli do adaptacji do amoksycyliny.
\- Zidentyfikowano istotne mutacje w regionie operonu ampC i genie frdD wpływające na ekspresję beta-laktamazy.
\- Odkryto znaczącą mutację D445V w genie rpoD (kodującym czynnik sigma 70), która wpływa na oporność na beta-laktamy.
\- Wszystkie badane szczepy wykazały jednolite tempo adaptacji do wysokich stężeń amoksycyliny (do 1024 μg/mL).
\- Zaobserwowano znaczące zmiany w systemie toksyna-antytoksyna prlF/yhaV oraz w ekspresji genów związanych z metabolizmem bakteryjnym.
\- Wyniki badań sugerują istnienie różnorodnych i redundantnych mechanizmów oporności bakteryjnej, co ma istotne znaczenie dla praktyki klinicznej.
Bibliografia
Teichmann Lisa, Wenne Marcus, Luitwieler Sam, Dugar Gaurav, Bengtsson-Palme Johan, ter Kuile Benno, Mienda Bashir Sajo, Mienda Bashir Sajo and Mienda Bashir Sajo. Genetic adaptation to amoxicillin in
