Przełom w walce z opornością na antybiotyki – nowy nanokompozyt w akcji

Jakie wyzwania stawia oporność na antybiotyki w medycynie?

Wzrost oporności bakterii na antybiotyki stanowi jedno z najpoważniejszych zagrożeń dla zdrowia publicznego na świecie. Zjawisko to przyczynia się do około 700 000 zgonów rocznie na całym świecie, a w samych Stanach Zjednoczonych zakażenia wywołane przez methicylino-oporny Staphylococcus aureus (MRSA) były w 2017 roku powiązane z około 120 000 przypadkami zakażeń krwi i 20 000 zgonów. Dodatkowo, bakterie z rodziny Enterobacteriaceae oporne na karbapenemy (CRE) zostały uznane za istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego, wymagające natychmiastowych, inwazyjnych działań. Rosnąca oporność na leki powoduje znaczne straty ekonomiczne – w USA sięgające 55-70 miliardów dolarów rocznie, a w Europie przekraczające 1,5 miliarda euro. W obliczu tych wyzwań naukowcy poszukują innowacyjnych rozwiązań, które mogłyby zwiększyć skuteczność istniejących antybiotyków.

Jedną z obiecujących strategii jest wykorzystanie nanocząstek jako nośników antybiotyków, które mogą przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych terapii, szczególnie w kontekście biofilmów bakteryjnych. Biofilm to złożona struktura tworzona przez bakterie, która umożliwia im przetrwanie w niekorzystnych warunkach i tworzenie trwałych kolonii. Składa się z gęstej, uwodnionej grupy bakterii przylegających do powierzchni i otoczonych zewnętrzną macierzą zbudowaną z pozakomórkowego DNA, aminokwasów i egzopolisacharydów (EPS). Struktury te wykazują nawet 1000-krotnie większą oporność na konwencjonalne antybiotyki w porównaniu do bakterii w formie planktonicznej i są związane z wieloma poważnymi infekcjami, w tym zakażeniami płuc, jelit, cewki moczowej, oczu, uszu, a także z zapaleniem wsierdzia, chorobami dziąseł i zakażeniami ran.

Czy nanotechnologia otwiera nowe perspektywy leczenia?

Proces zatwierdzania nowych antybiotyków jest długotrwały, kosztowny i złożony – często zajmuje od 10 do 15 lat. W połączeniu z pojawianiem się wysoce patogennych bakterii i brakiem rozwoju nowych antybiotyków, skuteczność obecnych terapii maleje. W odpowiedzi na te wyzwania zespół badawczy opracował nowatorski nanokompozyt łączący nanocząstki ferrytu cynku (ZnFe₂O₄) pokryte kwasem cytrynowym (CA) i sprzężone z amoksycyliną (AX), tworząc system ZnF-CA-AX. Amoksycylina została wybrana ze względu na jej szerokie spektrum działania przeciwbakteryjnego, istotność kliniczną oraz znane ograniczenia, takie jak krótki okres półtrwania i zmniejszona skuteczność przeciwko biofilmom. Jej struktura molekularna umożliwia efektywne wiązanie do powierzchni nanocząstek, co czyni ją odpowiednim antybiotykiem modelowym do oceny potencjału systemu nanokompozytowego.

Nanocząstki ferrytu cynku zsyntetyzowano metodą współstrącania, która jest najbardziej popularną i efektywną metodą tworzenia nanocząstek magnetycznych o kontrolowanych rozmiarach i właściwościach magnetycznych. Jest ona szczególnie preferowana w zastosowaniach biomedycznych ze względu na prostotę i minimalne wymagania dotyczące niebezpiecznych materiałów i procedur. Proces syntezy obejmował rozpuszczenie stechiometrycznych ilości bezwodnego chlorku żelaza (FeCl₃) i chlorku cynku (ZnCl₂·6H₂O) w wodzie destylowanej, neutralizację 1M roztworem wodorotlenku sodu (NaOH) w temperaturze 60°C, a następnie suszenie i spiekanie w temperaturze 600°C.

Powierzchnię nanocząstek stabilizowano kwasem cytrynowym, wykorzystując metodę bezpośredniego dodawania. Nanocząstki ZnFe₂O₄ inkubowano w roztworze kwasu cytrynowego (0,5 g/ml) przez godzinę, podnosząc temperaturę reakcji do 90°C i prowadząc proces przez 60 minut przy ciągłym mieszaniu. Sprzężenie amoksycyliny z nanocząstkami pokrytymi kwasem cytrynowym (CA-ZnF) przeprowadzono poprzez reakcję CA-ZnF z nadmiarem amoksycyliny w fazie wodnej, wykorzystując oddziaływania elektrostatyczne między grupami karboksylowymi na powierzchni nanocząstek a grupami aminowymi antybiotyku.

Charakterystyka otrzymanego nanokompozytu za pomocą zaawansowanych technik analitycznych potwierdziła skuteczną syntezę i funkcjonalizację. Analiza UV-Vis wykazała przesunięcie piku absorpcji z 230 nm dla czystych nanocząstek ZnF do 270 nm dla nanokompozytu ZnF-CA-AX, co wskazuje na skuteczną modyfikację powierzchni. Badania FTIR potwierdziły obecność charakterystycznych pasm dla ferrytu cynku (550 cm⁻¹), a także grup funkcyjnych pochodzących z kwasu cytrynowego (1661 cm⁻¹ i 1381 cm⁻¹) oraz amoksycyliny (pasma w zakresie 900-1200 cm⁻¹). Analiza XRD wykazała, że nanocząstki zachowują strukturę spinelu kubicznego po funkcjonalizacji, z obliczoną wielkością krystalitów wynoszącą 25 nm dla czystych nanocząstek ZnF i 35 nm dla nanokompozytu ZnF-CA-AX.

Jakie dowody potwierdzają skuteczność nanokompozytu?

Obrazowanie SEM i TEM potwierdziło sferyczny kształt cząstek i jednorodny rozkład wielkości. Nagie nanocząstki ZnF były wyjątkowo małe i półsferyczne, o średnim rozmiarze 25 nm (zakres 15-35 nm). Nanocząstki ZnF-CA miały gładką powierzchnię, sferyczny kształt i umiarkowany zakres wielkości 20-40 nm, ze średnicą około 30 nm. Analiza TEM nanokompozytu ZnF-CA-AX wykazała sferyczne cząstki o jednorodnym rozkładzie wielkości, ze średnią średnicą 35 nm, większą niż w przypadku nagich nanocząstek ZnF, co wynika z koniugacji z kwasem cytrynowym i amoksycyliną. Analiza EDX wykazała obecność pierwiastków Zn, Fe, C i O, co dodatkowo potwierdza skuteczną funkcjonalizację.

Badania aktywności przeciwbakteryjnej metodą dyfuzji dyskowej wykazały, że nanokompozyt ZnF-CA-AX wykazuje znacznie większą strefę zahamowania wzrostu (ZOI) wobec zarówno bakterii Gram-dodatnich (S. aureus) jak i Gram-ujemnych (E. coli) w porównaniu do czystych nanocząstek ZnF czy nanocząstek pokrytych tylko kwasem cytrynowym. Strefy zahamowania wzrostu dla ZnF-CA-AX wynosiły odpowiednio 17,0 mm dla S. aureus i 20,0 mm dla E. coli, co przewyższa aktywność samej amoksycyliny (13,0 mm dla S. aureus i 15,0 mm dla E. coli). Minimalne stężenie hamujące (MIC) nanokompozytu wynosiło 2,50 μg/ml dla S. aureus i 1,25 μg/ml dla E. coli, co wskazuje na znaczną poprawę skuteczności w porównaniu do konwencjonalnych terapii.

Właściwości antybakteryjne nanokompozytu nie zależą wyłącznie od rozmiaru; inne kluczowe czynniki, takie jak skład pierwiastkowy, czystość, powierzchnia właściwa i kształt, muszą być starannie uwzględnione. Nanokompozyt ZnF-CA-AX ma dwie zalety, które ułatwiają jego interakcję z organizmami biologicznymi, takimi jak bakterie i drożdże: wysoki stosunek powierzchni do objętości oraz strukturę nanometryczną.

Szczególnie imponujące były wyniki dotyczące aktywności przeciwbiofilmowej. Nanokompozyt ZnF-CA-AX wykazał zdolność do hamowania tworzenia biofilmu na poziomie 88,4% dla S. aureus i 93,7% dla E. coli przy stężeniu 10,0 μg/ml. Jest to niezwykle istotne odkrycie, biorąc pod uwagę, że biofilmy bakteryjne są jednym z głównych mechanizmów oporności na antybiotyki. W badaniach wykorzystano metodę testu rurkowego, gdzie E. coli w nieobecności nanokompozytu ZnF-CA-AX tworzyła skoncentrowany białawo-żółty film pokrywający całą granicę powietrze-ciecz. Po barwieniu fioletem krystalicznym film wykazywał okrągłą niebieską strukturę i wykazywał dużą przyczepność do wewnętrznych ścian probówek. Natomiast probówki, do których wprowadzono E. coli, a następnie poddano działaniu nanokompozytu ZnF-CA-AX w dawce 10,0 μg/ml, wykazały znaczący efekt hamujący.

Jak nanokompozyt oddziałuje na poziomie molekularnym?

Proponowany mechanizm działania nanokompozytu obejmuje generowanie reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają błony komórkowe bakterii, prowadzą do fragmentacji DNA i ostatecznie do śmierci komórki. ROS, takie jak rodniki hydroksylowe (•OH), aniony ponadtlenkowe (O₂•⁻) i tlen singletowy (¹O₂), mogą zakłócać błony bakteryjne, uszkadzać białka i powodować fragmentację DNA, ostatecznie prowadząc do śmierci komórki. Nanokompozyt ZnF-CA-AX opracowany w tym badaniu prawdopodobnie promuje generowanie ROS, co może synergistycznie działać z antybakteryjnym działaniem amoksycyliny, zwiększając skuteczność przeciwko szczepom opornym i tworzącym biofilm.

Dodatkowo, nanokompozyt wykazuje synergistyczne działanie z amoksycyliną, co pozwala na zwiększenie skuteczności antybiotyku przy potencjalnie niższych dawkach. Koniugat antybiotyk-nanocząstki działa na wiele miejsc w komórkach bakteryjnych, a nie tylko oddziałuje z lub przenika przez ścianę komórkową. Po dostaniu się do wnętrza, koniugaty te zakłócają istotne procesy regulacyjne, dezaktywują niezbędne białka bioaktywne i zakłócają interakcje siarka-fosfor w kwasach nukleinowych, ostatecznie hamując syntezę białek i zatrzymując wzrost bakterii.

Jakie dodatkowe korzyści oferuje zastosowanie nanokompozytu?

Oprócz działania przeciwbakteryjnego i przeciwbiofilmowego, nanokompozyt ZnF-CA-AX wykazał również znaczącą aktywność antyoksydacyjną. W teście z użyciem 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylu (DPPH), nanokompozyt wykazał 69,0% zdolności do neutralizacji wolnych rodników w porównaniu do 80,0% dla kwasu askorbinowego (kontrola pozytywna). Zaobserwowano, że kolor roztworu DPPH stopniowo zmienia się z głębokiego fioletu na blady żółty w obecności nanokompozytu ZnF-CA-AX. Analiza widm UV-Vis DPPH w obecności nanokompozytu ZnF-CA-AX w różnych odstępach czasu wykazała spadek absorbancji przy 517 nm, co wykorzystano do pomiaru zdolności nanocząstek do wychwytywania DPPH. Konsekwentny spadek intensywności przy 517 nm w czasie wykazał zdolność nanokompozytu ZnF-CA-AX do wychwytywania wolnych rodników. Ta dodatkowa właściwość może być korzystna w kontekście leczenia infekcji, gdzie stres oksydacyjny często towarzyszy procesowi zapalnemu.

Porównanie aktywności przeciwbakteryjnej ZnF-CA-AX z innymi nanomateriałami opisanymi w literaturze potwierdza jego wysoką skuteczność. Nanokompozyt wykazuje porównywalną lub lepszą aktywność niż wiele innych systemów, takich jak Fe₃O₄/Ag z sulfametoksazolem czy trimetoprimem, MgFe₂O₄ NPs z gentamycyną, czy nanocząstki srebra sprzężone z amoksycyliną. W innym badaniu przeprowadzonym przez Zhanga i współpracowników, nanocząstki załadowane klarytromycyną eliminowały populację H. pylori zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Efekt antybakteryjny nanocząstek załadowanych klarytromycyną był znacznie wyższy niż w przypadku wolnych antybiotyków klarytromycynowych. Jest to szczególnie istotne w kontekście poszukiwania nowych strategii w walce z bakteriami opornymi na wiele leków (MDR).

Jakie perspektywy kliniczne wiążą się z nowatorskim podejściem?

Opracowany nanokompozyt ZnF-CA-AX ma potencjalne zastosowanie w różnych dziedzinach medycyny, w tym jako składnik powłok antybakteryjnych na ścianach sal operacyjnych, maseczkach ochronnych, kosmetykach i opatrunkach na rany. Główne cechy nanocząstek magnetycznych, które są intensywnie wykorzystywane w zastosowaniach medycznych, to ich wysoka akumulacja w tkance lub narządzie docelowym, biokompatybilność, możliwość wstrzyknięcia i brak toksyczności. Jednak przed zastosowaniem klinicznym konieczne są dalsze badania dotyczące jego toksyczności i bezpieczeństwa stosowania. Niemniej jednak, przedstawione wyniki stanowią obiecujący krok w kierunku opracowania nowych strategii w walce z opornością na antybiotyki, szczególnie w kontekście zakażeń związanych z tworzeniem biofilmów.

Podsumowując, nanokompozyt ZnF-CA-AX stanowi innowacyjne podejście do zwiększenia skuteczności amoksycyliny przeciwko bakteriom tworzącym biofilmy. Dzięki synergistycznemu działaniu nanocząstek ferrytu cynku i amoksycyliny, system ten może przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych terapii antybiotykowych i stanowić obiecującą strategię w walce z rosnącą opornością na antybiotyki. Wyniki te podkreślają potencjał nanotechnologii w opracowywaniu nowych rozwiązań dla pilnych wyzwań w dziedzinie zdrowia publicznego.

Podsumowanie

Rosnąca oporność bakterii na antybiotyki stanowi globalne zagrożenie dla zdrowia publicznego, powodując około 700 000 zgonów rocznie na świecie. W odpowiedzi na ten problem, naukowcy opracowali innowacyjny nanokompozyt ZnF-CA-AX, łączący nanocząstki ferrytu cynku pokryte kwasem cytrynowym z amoksycyliną. System ten wykazuje znacznie wyższą skuteczność przeciwbakteryjną w porównaniu do konwencjonalnej amoksycyliny, szczególnie w zwalczaniu biofilmów bakteryjnych. Nanokompozyt skutecznie hamuje tworzenie biofilmu na poziomie 88,4% dla S. aureus i 93,7% dla E. coli. Mechanizm działania obejmuje generowanie reaktywnych form tlenu, które uszkadzają błony komórkowe bakterii i prowadzą do ich śmierci. Dodatkowo, nanokompozyt wykazuje właściwości antyoksydacyjne, neutralizując wolne rodniki z 69% skutecznością. Te obiecujące wyniki otwierają nowe możliwości w walce z opornością na antybiotyki, szczególnie w kontekście zakażeń związanych z tworzeniem biofilmów.